氘代內(nèi)標(biāo)在法庭毒物分析的應(yīng)用

      杜鴻雁，董穎，張蕾萍，欒玉靜，王瑞花，于忠山

     ( 公安部物證鑒定中心北京市現(xiàn)場(chǎng)物證檢驗(yàn)工程技術(shù)研究中心，北京100038)

    【摘要】法庭毒物分析實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部進(jìn)行質(zhì)量控制是保證毒物分析結(jié)果準(zhǔn)確、可靠的重要手段，在毒物分析中使用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行質(zhì)量控制是最有效方法。內(nèi)標(biāo)法使用的最佳內(nèi)標(biāo)物是與被測(cè)物結(jié)構(gòu)性質(zhì)極相近的氘取代物，即氘代內(nèi)標(biāo)。本文綜述了氘代內(nèi)標(biāo)在法庭毒物分析中的應(yīng)用與研制進(jìn)展，闡述了研制具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的氘代內(nèi)標(biāo)試劑，可降低對(duì)國外試劑的依賴度，促進(jìn)我國法庭毒物分析質(zhì)量控制的發(fā)展，產(chǎn)生良好的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。

    【關(guān)鍵詞】法醫(yī)毒物分析; 氘代內(nèi)標(biāo); 質(zhì)量控制

    【中圖分類號(hào)】DF795. 1 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1001－5728( 2015) 02－0152－04

    當(dāng)前，我國法庭毒物分析實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制體系發(fā)展愈發(fā)完善，要求也越來越高。同時(shí)，隨著司法體制的逐步健全，公民證據(jù)意識(shí)的增強(qiáng)，進(jìn)而越來越關(guān)注案件鑒定結(jié)論的質(zhì)量。因此，毒物分析的質(zhì)量控制顯得非常重要，并日益受到毒物分析工作者的重視。

    毒物分析方法可靠性的監(jiān)控，國際上普遍采用添加內(nèi)標(biāo)物的方法，即內(nèi)標(biāo)法。在選擇內(nèi)標(biāo)物時(shí)，為獲得嚴(yán)謹(jǐn)、準(zhǔn)確的分析結(jié)果，最佳的內(nèi)標(biāo)物是各毒物的氘代標(biāo)準(zhǔn)品，且在毒物分析中具有廣泛的應(yīng)用前景。然而，在國內(nèi)市場(chǎng)上銷售的氘代內(nèi)標(biāo)全部都是代理的國外產(chǎn)品，價(jià)格昂貴，而且不是每一種被分析物的氘代物都有售。因此，研制法庭毒物分析所用的氘代標(biāo)準(zhǔn)品，將填補(bǔ)我國氘代內(nèi)標(biāo)研制在此領(lǐng)域的空白，進(jìn)一步提高我國毒物分析質(zhì)量控制的水平。

    1 法庭毒物分析質(zhì)量控制與氘代內(nèi)標(biāo)

    當(dāng)前，毒物分析技術(shù)快速發(fā)展，已從定性分析發(fā)展到定量分析，從常量發(fā)展到微量、超微量分析。不僅限于胃內(nèi)容物的定性測(cè)定，并可通過體液、組織中微量毒物及代謝物的定性、定量，而判定體內(nèi)涉案毒物是陰性或是陽性; 若是陽性，則需進(jìn)一步判定其中毒量或致死量。因影響毒物分析結(jié)果的因素很多，而正確的分析與否，對(duì)中毒案件起著直接證據(jù)作用。

    作為毒物分析方法質(zhì)量控制有外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法。外標(biāo)法就是向空白樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)品監(jiān)控分析過程及結(jié)果。外標(biāo)法要求對(duì)整個(gè)操作過程嚴(yán)格控制，否則造成分析誤差。內(nèi)標(biāo)法是在待測(cè)樣品中添加內(nèi)標(biāo)物的方法進(jìn)行監(jiān)控，減少了許多客觀因素的影響。國際上普遍采用添加內(nèi)標(biāo)來保證分析方法的可靠性，該方法具有更高的準(zhǔn)確度和精密度。這種監(jiān)控方法可以避免毒物分析中，由于添加基質(zhì)不同以及平行操作產(chǎn)生的誤差，尤其是可以有效控制假陰性的發(fā)生。邱凈英等比較研究高效毛細(xì)管電泳內(nèi)標(biāo)法與外標(biāo)法進(jìn)行含量測(cè)定結(jié)果的差異，結(jié)果顯示外標(biāo)法檢測(cè)的結(jié)果較內(nèi)標(biāo)法偏低，高效毛細(xì)管電泳內(nèi)標(biāo)法比外標(biāo)法含量測(cè)定結(jié)果理想。楊小姣等以成品啤酒為樣品，將啤酒蒸餾后，使用氣相色譜儀，采用外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法對(duì)啤酒中的高級(jí)醇進(jìn)行定量分析，以比較兩種定量方法的優(yōu)缺點(diǎn)。結(jié)果表明: 一般情況下，內(nèi)標(biāo)法比外標(biāo)法準(zhǔn)確。吳艷等就如何選擇內(nèi)標(biāo)法或外標(biāo)法進(jìn)行探討時(shí)指出: 對(duì)于精密度要求比較高、結(jié)果準(zhǔn)確度會(huì)產(chǎn)生重大影響的條件下，首先選擇內(nèi)標(biāo)法。采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行分析時(shí)，為獲得最嚴(yán)謹(jǐn)、最準(zhǔn)確的分析結(jié)果，最佳的內(nèi)標(biāo)物是各毒物的氘代標(biāo)準(zhǔn)品。

    在我國，采用與待測(cè)毒物具有相同分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定同位素2H( D) 標(biāo)記的有機(jī)物氘代標(biāo)準(zhǔn)品，作為內(nèi)標(biāo)的分析方法已經(jīng)成為法庭科學(xué)領(lǐng)域?qū)Χ疚锓治鲞M(jìn)行嚴(yán)格質(zhì)量控制的發(fā)展趨勢(shì)。使用同位素2H( D) 標(biāo)記的化合物作為內(nèi)標(biāo)，避免了由于臟器組織和體液復(fù)雜的基質(zhì)效應(yīng)、前處理和質(zhì)譜檢測(cè)器等因素對(duì)分析方法測(cè)定結(jié)果的影響，有效地校正方法中出現(xiàn)的誤差，顯著提高目標(biāo)化合物的回收率和方法穩(wěn)定性，可以使分析方法的定性、定量準(zhǔn)確性大大提高。

    2 氘代內(nèi)標(biāo)的應(yīng)用

    2. 1 氘代內(nèi)標(biāo)在國外的應(yīng)用

    在國外，毒物分析工作者普遍采用添加被測(cè)毒物的氘代內(nèi)標(biāo)物對(duì)分析方法進(jìn)行質(zhì)量控制。Dan 等以氘代物為內(nèi)標(biāo)，采用液液萃取、氣相色譜質(zhì)譜法檢測(cè)人血中的苦參堿，結(jié)果顯示苦參堿的線性范圍為10 ～ 500ng /mL，日間和日內(nèi)精密度分別為0. 4% ～4. 0%、1. 0% ～ 3. 5%，定量限為23ng /mL。Jianmei 等建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法( LC-MS /MS) 測(cè)定人血中的拉帕替尼的分析方法，在使用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量時(shí)，作者對(duì)非同位素標(biāo)記和同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行了比較，結(jié)果表明: 氘代拉帕替尼具有與拉帕替尼最為接近的物理和化學(xué)性質(zhì)，在提取血樣前加入氘代拉帕替尼可以校正由于樣本凈化過程中對(duì)拉帕替尼造成的損失; 在檢測(cè)時(shí)，由于氘代拉帕替尼與拉帕替尼受干擾組分的影響幾乎一致，可以校正質(zhì)譜離子化過程中干擾組分對(duì)拉帕替尼離子的抑制或增強(qiáng)作用，從而獲得了更加準(zhǔn)確的測(cè)定結(jié)果。Wang 等用卡維地洛-D5

    作為同位素內(nèi)標(biāo)，建立了人血中卡維地洛的LC-MS /MS 分析方法，并就使用氘代內(nèi)標(biāo)可以有效降低或消除液相色譜-質(zhì)譜分析中的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行了詳盡探討。該作者指出，同位素內(nèi)標(biāo)是消除基質(zhì)效應(yīng)首選的內(nèi)標(biāo)物，同位素內(nèi)標(biāo)與目標(biāo)物具有相同的化學(xué)性質(zhì)和相同的保留時(shí)間，因此可以抵消質(zhì)譜離子化過程中的基質(zhì)效應(yīng)，同時(shí)消除前處理過程中的差異。Antignac 等對(duì)20 個(gè)組織中添加醋酸曲安縮松的樣品進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，使用氟氫可的松作內(nèi)標(biāo)時(shí)信號(hào)強(qiáng)度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為32. 6%，使用同位素內(nèi)標(biāo)醋酸曲安縮-D6，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差可降為5. 7%。

    2. 2 氘代內(nèi)標(biāo)在我國的應(yīng)用

    在我國，也有部分學(xué)者采用氘代內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行分析檢測(cè)。甘盛等建立了液相-質(zhì)譜串聯(lián)法測(cè)定人血漿中的沙丁胺醇含量。血漿離心后過玻璃纖維濾膜，經(jīng)酶解加入沙丁胺醇-D3內(nèi)標(biāo)溶液，用C18小柱凈化后以3%的氨水甲醇溶液對(duì)Oasis MCX 小柱進(jìn)行洗脫，吹干，以0. 1%甲酸水溶液-甲醇溶液( 95 ∶ 5) 溶解殘余物，用液相-質(zhì)譜串聯(lián)法測(cè)定，以0. 1% 甲酸乙腈溶液和0. 1% 甲酸溶液為流動(dòng)相梯度洗脫。結(jié)果表明沙丁胺醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好，靈敏準(zhǔn)確、重現(xiàn)性與特異性強(qiáng)、干擾少，可用于人體內(nèi)沙丁胺醇的檢驗(yàn)研究。展長(zhǎng)淑等以嗎啡-D3、嗎啡-3-葡萄糖醛酸苷-D3為內(nèi)標(biāo)，建立了尿液中同時(shí)分析可待因、6-單乙酰嗎啡、嗎啡、嗎啡-3-葡萄糖醛酸苷和嗎啡-6-葡萄糖醛酸苷的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法，該方法具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，可以滿足法庭毒物分析的需要。黃克建等以丁丙諾啡-D4和去環(huán)丙甲基丁丙諾啡-D3為內(nèi)標(biāo)物，建立了尿液中丁丙諾啡及去環(huán)丙甲基丁丙諾啡的GC-MS 分析方法;方法的線性范圍為0. 05 ～ 4. 0μg /mL，檢出限分別為0. 001 7μg /mL、0. 008 5μg /mL，回收率＞ 86%，ＲSD分別為1. 5%、2. 3%。

    氘代內(nèi)標(biāo)作為分析方法質(zhì)量控制的最有效手段，已經(jīng)在美國和歐洲等發(fā)達(dá)國家廣泛使用。在我國，由于氘代內(nèi)標(biāo)物價(jià)格昂貴，而且種類受限，使氘代內(nèi)標(biāo)的應(yīng)用受到一定限制，大部分毒物分析工作者選擇采用其它內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行質(zhì)控分析，一般選用與被測(cè)物結(jié)構(gòu)相似、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的化合物作內(nèi)標(biāo)。劉冬嫻等用奮乃靜作內(nèi)標(biāo)物，建立了血漿中丁丙諾啡的液相色譜-質(zhì)譜分析方法。李兵等以非那西丁為內(nèi)標(biāo)，建立了高效液相色譜法測(cè)定人血漿中沙利度胺的分析方法。劉縉等以SKF525作內(nèi)標(biāo)物，建立了人血、尿中地芬尼多的氣相色譜快速分析方法。

    3 氘代內(nèi)標(biāo)的研制

    目前，國內(nèi)尚無涉案毒物氘代內(nèi)標(biāo)的商品化產(chǎn)品，而法庭科學(xué)領(lǐng)域又急需該類物質(zhì)用于毒物分析質(zhì)量控制。但是由于國外在技術(shù)上的壟斷，氘代內(nèi)標(biāo)試劑均依賴進(jìn)口，發(fā)達(dá)國家在氘代內(nèi)標(biāo)試劑制備方面已經(jīng)形成一個(gè)具有顯著經(jīng)濟(jì)效益的高科技產(chǎn)業(yè)，擁有較為完整的技術(shù)和產(chǎn)業(yè)鏈，由于技術(shù)保密和產(chǎn)品壟斷等原因，有關(guān)合成的技術(shù)文獻(xiàn)和專利幾乎未見報(bào)道。同時(shí)，與發(fā)達(dá)國家的毒物集中于濫用藥物和治療藥物不同，我國還包括大量的農(nóng)藥、鼠藥、中草藥等具有地域特征的毒物，而該類毒物的氘代內(nèi)標(biāo)在國外和國內(nèi)市場(chǎng)均屬空白。因此，制備具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的涉案毒物的氘代內(nèi)標(biāo)試劑，降低對(duì)國外試劑的依賴度并打破國外封鎖，不僅能夠大力促進(jìn)我國法庭毒物分析的快速發(fā)展，還可以創(chuàng)造可觀的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。

    3. 1 國外氘代內(nèi)標(biāo)的研制在國外，一些從事毒物分析的學(xué)者在被測(cè)物的氘代內(nèi)標(biāo)物通過購買難以獲得時(shí)，會(huì)選擇自己合成內(nèi)標(biāo)物，然后使用該內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行分析檢測(cè)。如Uta 等合成了琥珀酰膽堿-D18及其代謝物琥珀酰單膽堿-D3并通過NMＲ、HPLC-MS /MS 等手段對(duì)其進(jìn)行表征，用于檢測(cè)肌肉松弛劑琥珀酰膽堿及其代謝物琥珀酰單膽堿的質(zhì)譜分析。Hans 等合成了雌三醇-D3，用其作內(nèi)標(biāo)，建立了人血漿中雌三醇的GC-MS 分析方法。

    3. 2 我國氘代內(nèi)標(biāo)的研制

    近年來，國內(nèi)在氘代內(nèi)標(biāo)物的研制上取得了一定進(jìn)展，如費(fèi)榮杰研制出磺胺甲噁唑-D4和磺胺喹噁啉-D4用作磺胺類藥物殘留檢測(cè)的內(nèi)標(biāo)，徐仲杰等等研制出蘇丹紅I-D5，作為內(nèi)標(biāo)試劑用于食品安全蘇丹紅系列違禁染料的檢測(cè)。在法庭科學(xué)領(lǐng)域，公安部物證鑒定中心已經(jīng)成功研制四種苯二氮艸卓 類安眠鎮(zhèn)靜藥物的氘代內(nèi)標(biāo)物，在實(shí)際應(yīng)用中具有較好的穩(wěn)定性，為法庭毒物分析質(zhì)量控制奠定了基礎(chǔ)。但是，上述氘代內(nèi)標(biāo)物的制備目前僅限于實(shí)驗(yàn)室水平，急需擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模，進(jìn)一步提高穩(wěn)定性和產(chǎn)出率，同時(shí)，還需逐步擴(kuò)大內(nèi)標(biāo)物研制種類和范圍，逐漸實(shí)現(xiàn)全領(lǐng)域覆蓋和應(yīng)用。

    4 結(jié)語

    涉案毒物的氘代內(nèi)標(biāo)物在毒物分析質(zhì)量控制領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，而進(jìn)口氘代內(nèi)標(biāo)物的高價(jià)格且品種不齊全已成為制約毒物分析方法評(píng)價(jià)的瓶頸，給國內(nèi)涉案毒物分析的質(zhì)量控制帶來了十分被動(dòng)的局面。制備涉案毒物的氘代內(nèi)標(biāo)物，并建立采用氘代內(nèi)標(biāo)進(jìn)行分析檢驗(yàn)的國家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，并將其用于我國各級(jí)司法的毒物分析部門，大力提高毒物分析技術(shù)能級(jí)，加快與國際先進(jìn)接軌的步伐。氘代內(nèi)標(biāo)的國產(chǎn)化將填補(bǔ)國內(nèi)在此專業(yè)領(lǐng)域的空白，打破國外試劑以及其昂貴的價(jià)格壟斷國內(nèi)市場(chǎng)的局面，同時(shí)降低科研和應(yīng)用成本，對(duì)于以后法庭科學(xué)領(lǐng)域毒物分析方法進(jìn)行嚴(yán)格質(zhì)量控制，以及全面提升我國毒物分析水平打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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